Enzim reverse transkriptase berperan pada infeksi sel normal menjadi sel tumor bahkan sel kanker, ketika RNA virus masuk ke dalam sel, RNA memberikan enzim transkriptasenya. Enzim ini mensintesis DNA-RNA yang dobel heliks yang kemudian secara enzimatis diubah menjadi DNA-DNA yang dobel heliks yang dapat menggabungkannya ke dalam kromosom sel inangnya. Setelah penggabungan, DNA di transkripsikan menjadi RNA yang sama-sama ditranslasikan dan dikemas dalam partikel virus yang baru yang kemudian dilepaskan dari sel untuk menginfeksi sel inang lainnya dan mengulang proses transkripsi balik ini kembali.

Enzim reverse transcriptase umumnya digunakan dalam riset untuk menerapkan teknik polymerase chain reaction untuk RNA dalam teknik yang disebut reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Teknik PCR klasik dapat diterapkan hanya pada untai DNA, tetapi dengan bantuan enzim reverse transcriptase, RNA dapat ditranskripsi menjadi DNA  sehingga membuat analisis PCR molekul RNA dapat dilakukan. Misalnya dalam bidang kessehatan, yakni analisa suatu penyakit yang disebabkan oleh virus atau protein tertentu (alergen) yang dapat diketahui dari susunan mRNA yang dihasilkan. Selain itu, RT-PCR juga digunakan dalam mempelajari genom genom virus yang terdiri dari RNA  seperti Influenzavirus A dan retrovirus seperti HIV.

Reverse transcriptase juga digunakan untuk membuat perpustakaan cDNA dari mRNA. Ketersediaan komersial enzim reverse transcriptase, dapat menyokong penemuan ilmu pengetahuan dalam bidang biologi molekular seperti kloning, sequencing DNA, dan hibridisasi DNA.Dari proses tersebut dapat dilihat bahwa RNA dapat menjadi cetakan untuk membuat kopi DNA untai ganda. Adanya enzim transcriptase ini menguntungkan dalam rekayasa gen. Semula, untuk mencari gen dimulai dengan mengisolasi seluruh DNA genomnya baru kemudian dipotong-potong menjadi ratusan potong kemudian mempelajarinya satu-persatu. Hal ini tentu membutuhkan waktu yang cukup lama. Dengan adanya enzim transcriptase ini, yang diperlukan adalah mengisolasi mRNA yang kemudian menjadi cetakan untuk membuat DNA yang dobel heliks.

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah varian dari Polymerase Chain Reaction (PCR), teknik laboratorium yang biasa digunakan dalam molekuler biologi untuk menghasilkan banyak salinan sekuen DNA, suatu proses yang disebut “amplifikasi”. Pada RT-PCR, untai RNA ditranskripsi balik ke dalam DNA komplemen (DNA komplementer, atau cDNA) menggunakan enzim reverse transkriptase, dan cDNA yang dihasilkan diperkuat menggunakan input atau real-time PCR.

RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang melengkapi urutan yang ditetapkan pada masing-masing dari kedua untai cDNA. Primer ini kemudian diperpanjang oleh enzim DNA polimerase dan salinan dari rantai tersebut dibuat setelah setiap siklus, menuju logaritmik amplifikasi. RT-PCR mencakup tiga langkah utama, dapat dijelaskan sebagai berikut:

  1. Transkripsi balik (RT), di mana RNA ditranskripsi balik untuk cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer. Langkah ini sangat penting dalam rangka untuk melakukan polimerisasi DNA. Langkah RT dapat dilakukan baik dalam tabung yang sama dengan PCR (one step PCR) atau dengan memisahkan satu (two step PCR) menggunakan suhu antara 40 ° C dan 50 ° C, tergantung pada sifat-sifat reverse transcriptase digunakan. One Step PCR yaitu enzim reverse transcriptase digabung dalam satu tube bersama reagen-reagen PCR, sedangkan untuk two step PCR , proses transkipsi balik dan amplifikasi dilakukan secara terpisah.
  2. Langkah selanjutnya melibatkan denaturasi dari dsDNA pada 95 ° C, sehingga kedua untai primer terpisah dan dapat mengikat lagi pada suhu yang lebih rendah dan memulai reaksi berantai baru. Kemudian, suhu menurun hingga mencapai temperatur anil yang dapat bervariasi tergantung pada set primer yang digunakan, konsentrasi sampel, dan konsentrasi kation. Pertimbangan utama, tentu saja, ketika memilih temperatur anil optimal adalah temperatur leleh (Tm) dari primer dan probe (jika digunakan). Anil suhu yang dipilih untuk PCR langsung tergantung pada panjang dan komposisi primer. Ini adalah hasil dari perbedaan ikatan hidrogen antara AT (2 obligasi) dan GC (3 obligasi). Anil temperatur sekitar 5 derajat di bawah temperatur terendah dari sepasang primer biasanya digunakan.
  3. Langkah akhir amplifikasi PCR DNA perpanjangan dari primer. Hal ini dilakukan dengan DNA polimerase Taq tahan panas, biasanya pada suhu 72 ° C, suhu di mana enzim bekerja secara optimal. Panjang inkubasi pada setiap suhu, perubahan suhu, dan jumlah siklus dikendalikan oleh pengendara sepeda diprogram termal. Analisis produk PCR tergantung pada jenis PCR diterapkan. Jika PCR konvensional digunakan, produk PCR dideteksi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa dan ethidium bromida (atau lainnya menodai asam nukleat).

RT-PCR konvensional adalah teknik PCR yang memakan waktu dengan keterbatasan tertentu jika dibandingkan dengan teknikReal-Time PCR. Hal ini, dikombinasikan dengan fakta bahwa bromida ethidium memiliki sensitivitas rendah, hasil tidak selalu dapat diandalkan. Selain itu, terdapat peningkatan resiko kontaminasi silang dari sampel sejak deteksi dari produk PCR memerlukan pengolahan pasca-amplifikasi sampel. Selanjutnya, spesifisitas dari assay ditentukan oleh primer, yang dapat memberikan hasil positif palsu. Namun, yang paling penting mengenai kelemahan RT-PCR konvensional adalah fakta bahwa ia adalah semi-atau bahkan merupakan teknik kuantitatif rendah sehingga memerlukan teknik Real-Time PCR sebagai pendukung.

About JavAurora

Aku bagai berjalan di atas air, beriak tapi tak berbekas

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s